phredによるベースコール

　オートシーケンサから得られるデータは塩基配列そのものではなく、多くの場合各塩基に対応した波長光のシグナル強度の時間的変化を記録した波形ファイルとなっている。シーケンサの制御ソフトが標準でそのデータから塩基配列を読み出す(この操作をベースコールと呼ぶ)ものもあるが、エラーの有無を確認したり、信頼性を評価するには直に波形ファイルを扱った方がよい。

　ここでは、優秀なベースコールソフトウェアであるphredを利用して日立製スラブゲル型オートシーケンサSQ-5500から得られるSCFファイルと、AppliedBiosystems製キャピラリ型オートシーケンサPrism 310および3730xlから得られるAB1ファイルからベースコールを行い、phredが出力するベースコールの信頼性と波形を同時に参照しながら配列を確認・編集するまでを説明する。SCF・AB1共にシーケンサ制御マシンがMacOS 8/9機の場合、拡張子が無いかもしれませんがWindows機のphredでも問題無く扱えます。ただしMacバイナリ(MacではWindowsのように拡張子と対応ソフトを関連付けるのではなく、ファイル本体にそのファイルを作成したソフトなどの情報を付加します。それがMacバイナリで、Windows/UNIX機上ではファイル本体にくっついたゴミでしかありません。)を除去する必要があるかもしれません。Macバイナリカッターとかmacutilsなどというソフトで除去できるようです。

　最近のABI製マシンではKB Basecallerという優秀なベースコールソフトウェアが付属しており、phred同様に信頼性を評価することができます。ABIから無料で配布されているWindows用のSequence Scannerという閲覧・編集用ソフトウェアを用いてこれらのファイルを扱うことができます。

必要なソフトウェア

phred

　当然これが無くては始まらない。学術研究利用なら無料で入手できます。リンク先から「How to get」の項を読んで入手して下さい。私が入手したときと変わっていなければ、指定のメールアドレスに必要事項を記入してメールを送ると返信メールの添付ファイルとしてソースコードが送られてくるはずです。コンパイルとインストールに関しては後述。

phredの出力する信頼性を表示可能なソフト

　無料で使えるものに以下のようなものがあります。

FinchTV (Windows/Linux/MacOS X)
4Peaks (MacOS X)
TraceViewer (Java)
Trev (Staden Packageに収録) (Windows/Linux/MacOS X/その他UNIX)

　他にもありますが、系統推定ではシンプルなこれらが使いやすいと思います。

phredのコンパイルとインストール

　既に述べたように、phredはソースコードの形で送られてきますので、コンパイルする必要があります。UNIX、MacOS Xの場合はコンパイラが標準で入っているか、簡単に導入できるはずです。Windowsの場合はMinGW + MSYSかServices for UNIX(WinXP Homeでは使用不可)などを導入すればいいでしょう。導入方法はここでは説明しません。CygwinやcoLinuxでも構いません。

コンパイル

　とりあえずターミナルが立ち上げられるようになっていることを前提に説明します。ソースコードの入った圧縮ファイル(phred-dist-xxxxxx.c-acd.tar.Z)のあるディレクトリで以下のコマンドを実行します。

% mkdir phred
% cd phred
% tar xvzf ../phred-dist-xxxxxx.c-acd.tar.Z
% make

　これでコンパイルができるはずですが、もしccが無いというエラーが出た場合(MinGWとか)は最後のコマンドを

% make CC=gcc

として下さい。これで実行ファイルができあがります。

インストール

　phredは環境変数PHRED_PARAMETER_FILEに設定されている設定ファイルを読み込んで動作します。配布ファイルを展開すると出てくるphredpar.datが標準の設定ファイルです。やや旧式のメジャーなシーケンサなら編集せずに使用しても問題無いと思いますが、ここで扱うSQ-5500とPrism 310および3730xlでは設定が必要です。UNIX改行コードが扱えるエディタで以下の3行を末尾に加えて下さい。

"DT310POP6{BDv3}v1.mob" terminator big-dye ABI_3100
"KB_3730_POP7_BDTv3.mob" terminator big-dye ABI_3700
"" terminator big-dye Beckman_CEQ_2000

　1行目はABI Prism 310 + BigDye Terminator v3.x Cycle Sequencing Kit + POP6泳動したファイルの場合、BigDyeを用いてDye Terminator法で標識したサンプルをABI 3100で泳動したものとしてベースコールを行うという設定です。2行目がABI 3730xl + BigDye Terminator v3.x Cycle Sequencing Kit + POP7泳動の場合、BigDyeを用いてDye Terminator法で標識したサンプルをABI 3700で泳動したものとして、3行目は設定ファイル内のどの条件にも一致しないサンプルは、BigDyeを用いてDye Terminator法で標識したサンプルをBeckman CEQ 2000で泳動したものとしてベースコールを行うという設定です。SQ-5500 + Amersham Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit + LongRangerゲル泳動のSCFファイルはこの設定でベースコールするのが経験上最も良い(というか、マシ)のでこのようにしていますが、適当に変えていただいても構いません。

　DT310POP6{BDv3}v1.mobやKB_3730_POP7_BDTv3.mobなどに当たるものが分からない場合はとりあえずphredでベースコールしてみればエラーメッセージに出ますので、それを見ればいいでしょう。例えば上記の1行目をphredpar.datに加えずにphredでABI Prism 310の出力ファイルを処理しようとすると以下のようなメッセージが出ます。

  ファイル名
  ファイル名: unable to match primer ID string: skipping chromatogram
    unknown chemistry (DT310POP6{BDv3}v1.mob) in chromat ファイル名
    add a line of the form
    "DT310POP6{BDv3}v1.mob"    <chemistry>      <dye type>      <machine type>
    to the file C:\Windows\system32\phredpar.dat
    type `phred -doc' for more information

　phredpar.datを編集したら、適当な場所に置いておきます。Windowsの場合はコンパイルしてできるphred.exeと共にC:\Windows\System32にでも置いて

set PHRED_PARAMETER_FILE=C:\Windows\system32\phredpar.dat

をコマンドプロンプトで実行して環境変数を設定します。「コントロールパネル→システム→詳細設定→環境変数」から設定しても構いません。Win9x/Me機ではAUTOEXEC.BATに上記の行を追記して下さい。

　各種UNIX、MacOS Xの場合は

% su
# mkdir /usr/local/etc/phred
# cp phred phredpar.dat /usr/local/etc/phred
# echo -e "#!/bin/sh\nPHRED_PARAMETER_FILE=\
/usr/local/etc/phred/phredpar.dat \
/usr/local/etc/phred/phred $*" > /usr/local/bin/phred
# chmod 755 /usr/local/bin/phred
# exit

とでもすればよいだろう(インストール先は適宜変更)。この例では/usr/local/etc/phredにphredとphredpar.datを置いておき、環境変数と引数を与えてphredを起動するshスクリプト(/usr/local/bin/phred)を実行ファイルとして作成している。

phredでベースコールする

　ベースコールの対象となるファイルのある場所で以下のコマンドを実行する。

phred 入力ファイル名 -c 出力ファイル名

　これで、Standard Chromatgram Format(SCF)の出力ファイルが得られる。入力ファイルはSCFでもAB1でも問題無い。出力ファイルにはベースコールに用いた波形とベースコール後の塩基配列、各塩基配列の信頼性の情報が全て含まれている。塩基配列のみ、信頼性のみをそれぞれ出力することもできるが、ファイルが別々になり管理が面倒なので筆者はSCFファイルで出力するようにしている。

　ファイルが大量にある場合、上記のように1ファイルずつ処理するのは面倒である。そこで、入力ファイル名の代わりに「-if 入力ファイルリストの記述してあるテキストファイル」や「-id 入力ファイルのあるディレクトリ」を使うことで一気に大量のファイルを処理することができる。例えば、

mkdir basecalled
phred -id 入力ディレクトリ -cd basecalled

とすれば、入力ディレクトリ内の処理可能なファイルが全て処理され、同じファイル名でbasecalledディレクトリにSCFファイルが出力される。ただし残念ながらサブディレクトリまでは処理されない。Windowsの場合、

mkdir %1\basecalled
phred -id %1 -cd %1\basecalled

と書いたバッチファイル(またはそのショートカット)を「送る」(SendTo)に入れておくと、エクスプローラ上でディレクトリを右クリックから一発でディレクトリ内のファイルを処理できる。

　その他のオプションについては

phred -doc

の出力を見て下さい。

ベースコール結果を確認・編集

　あとは出力されたファイルを前述のソフトで開けばベースコールの結果を確認し、おかしいところがあれば編集することができます。4Peaksは知りませんが、FinchTVとTraceViewerにはFASTA形式で塩基配列を出力する機能がありますので、様々なソフトに読み込むことができます。

結果を FinchTVで表示

　波形の上にベースコールの結果の塩基、その上に信頼性を表す棒グラフが表示されている。縮小しているため見えなくなっているが、信頼性が十分か不十分かの基準となる線も表示されている。その線よりも棒グラフが高いデータはほぼ見直す必要が無い。FinchTVでは水平方向・垂直方向のスケールを下と左のバーで独立に変更することができる。手動で修正した塩基にはアンダーラインが付く。標準では1段表示だが「View→Wrapped View」で折り返し多段表示に変更できる。

結果を TraceViewerで表示

　波形の上にベースコールの結果の塩基、その上に信頼性を表す棒グラフが表示されている。信頼性の高いデータでは棒グラフは黒、ほぼ問題無いデータでは青、見直す必要のあるデータでは赤となる。赤く表示されているのに高い棒グラフのデータは手動で編集したもの。垂直方向のスケールは調整可能だが水平方向は固定。

結果をTrevで表示

　下から編集後の塩基配列、編集前の塩基配列、波形データ、信頼性の棒グラフ。信頼性がMAXなのは手動で編集したもの。標準では編集後の配列と信頼性は表示されないが、「View」メニューで「Display edits」と「Display confidence」にチェックを入れると表示されるようになる。配列編集時には「Edit」メニューで「Sequence」をチェックしてから行う。垂直・水平方向のスケールは左側のバーで調整可能。

結果を Sequence Scannerで表示

　Sequence Scannerはphredが吐き出すSCFファイルを扱うことができませんので、信頼性値を表示させたければKB BasecallerでベースコールしたAB1ファイルを読み込ませる必要があります。SCF2ABIというソフトでSCFファイルからABI形式へ変換することもできますが、この際に信頼性値は失われますので意味がありません。

　ベースコール元の波形の上にシーケンサが吐いたRawデータの波形、さらにベースコール結果の塩基と信頼性を表す棒グラフが表示されている。水平方向・垂直方向のスケールを任意に変更可能。信頼性の低い塩基にTabキーで飛ぶことができるのが便利。

最終更新時間：2006年11月22日 23時04分26秒

phredによるベースコール