PCR with Phusion

[実験プロトコル]

PCR with Phusion

　PhusionでのPCRプロトコル。

必要なもの

• 適当なチューブ 1本
• 600ulチューブ 1本 or 8連チューブ 1/8本 /sample
• 5x Phusion HF Buffer 4ul /sample
• 10mM(2.5mM each) dNTPs Mixture 2ul /sample
• 5〜10uM Primer 2ul x2 /sample
• ミリQ 8.8ul /sample
• Phusion 0.2ul /sample
• 鋳型DNA水溶液 1ul

手順

1. 使用するチューブが入るチューブ立てを冷凍庫に入れておく
2. チューブに5x Phusion HF Buffer 4ul、10mM(2.5mM each) dNTPs Mixture 2ul、5〜10uM Primer 2ul x2、ミリQ 8.8ulをサンプル数+2(ネガコン+マージン)だけ入れる
3. 使用するチューブに鋳型DNA水溶液を1ul(ネガコンではSPW 1ul)入れておく (あらかじめ薄くしておいてピペットで取りやすい量入れてもよい。ただし2でミリQを減らすこと)
4. 2を氷上に移してPhusion 0.2ulをサンプル数+2倍加える
5. 3を1のチューブ立てに移して4を19ulずつ加える
6. 必要ならミネラルオイルを一滴加える
7. サーマルサイクラーにセットしてPCR
8. アガロースゲル電気泳動でスクリーニング

典型的な反応サイクル

1. 98℃ 30s
2. 98℃ 10s
3. 48℃ 30s
4. 72℃ 30s 2へ30回
5. 72℃ 5m

　HotStart用でも同じ。アニーリング温度はTaqでの場合より+3℃にする。伸長時間はTaqの半分。