トップ 差分 一覧 Farm ソース 検索 ヘルプ PDF RSS ログイン

Illumina用アダプター付きプライマー

[系統解析のための色々]

Illumina用アダプター付きプライマー

 Illuminaのシーケンサでマルチプレックスする場合、アダプター付きプライマーでPCRを行うことで、PCR産物にアダプターを付加する。また、シーケンス時に最初の6塩基の多様性が高くなるように、最初の6塩基がコンセンサスを取ったときにNになるようにする。具体的には、4種類のプライマーを用意し、それぞれにTGCAGT、CATGTC、ACGTAG、GTACCAを付加する(リバース側はGACGAT、TCATGA、AGTCTC、CTGACGを使う)。これらを混合すると、最初の6塩基はNとなり、しかも各塩基の比率は等しくなる。さらに、その後ろにNを0塩基にしたものと2塩基にしたものと4塩基にしたものと6塩基にしたものを混合して使用する。このNも、コンセンサスがNになるように決定する(実際にはNにせず、コンセンサスがNになるようにする)。また、GC含量が半分程度になるように留意する。なお、最初の6塩基がNになることが最重要なので、その後ろの長さに変異を持たせるのが面倒であれば省略してもよい。

アダプター配列

以下はNexteraで使用されているアダプター配列。

  • F TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNN
  • R GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNN

また、以下のTruSeqで使用されているアダプター配列でも使用可能です。

  • F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN
  • R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNN

作成例

  • F Euk1391f-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GTACAC ACCGCCCGTC
  • F Euk1391f-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC CAGTAC ACACCGCCCGTC
  • F Euk1391f-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG AGCAGT ACACACCGCCCGTC
  • F Euk1391f-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA TCTGYR GTACACACCGCCCGTC
  • R EukBr-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACGAT TGATCC TTCTGCAGGTTCACCTAC
  • R EukBr-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TCATGA ACTGAT CCTTCTGCAGGTTCACCTAC
  • R EukBr-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AGTCTC GAGCTG ATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC
  • R EukBr-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CTGACG CTCAGA TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC
  • F jgLCO1490-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT TITCIA CIAAYCAYAARGAYATTGG
  • F jgLCO1490-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC CMTITC IACIAAYCAYAARGAYATTGG
  • F jgLCO1490-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG ARVMTI TCIACIAAYCAYAARGAYATTGG
  • F jgLCO1490-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA GYVAMK TITCIACIAAYCAYAARGAYATTGG
  • R mlCOIintR-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACGAT GGRGGR TASACSGTTCASCCSGTSCC
  • R mlCOIintR-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TCATGA ATGGRG GRTASACSGTTCASCCSGTSCC
  • R mlCOIintR-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AGTCTC CAYHGG RGGRTASACSGTTCASCCSGTSCC
  • R mlCOIintR-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CTGACG TCCHYY GGRGGRTASACSGTTCASCCSGTSCC
  • F mlCOIintF-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GGWACW GGWTGAACWGTWTAYCCYCC
  • F mlCOIintF-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC TAGGWA CWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
  • F mlCOIintF-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG CTCTGG WACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
  • F mlCOIintF-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA ACACWC GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
  • R jgHCO2198-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACGAT TAIACY TCIGGRTGICCRAARAAYCA
  • R jgHCO2198-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TCATGA AGTAIA CYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
  • R jgHCO2198-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AGTCTC CTCBTA IACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
  • R jgHCO2198-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CTGACG GCABRG TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
  • F MiFish-U-F-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GTCGGT AAAACTCGTGCCAGC
  • F MiFish-U-F-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC TAGTCG GTAAAACTCGTGCCAGC
  • F MiFish-U-F-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG ACTAGT CGGTAAAACTCGTGCCAGC
  • F MiFish-U-F-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA CGACWM GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC
  • R MiFish-U-R-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACGAT CATAGT GGGGTATCTAATCCCAGTTTG
  • R MiFish-U-R-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TCATGA GTCATA GTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
  • R MiFish-U-R-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AGTCTC AGABCA TAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
  • R MiFish-U-R-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CTGACG TCGBAS CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
  • F MiFish-E-F-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GTTGGT AAATCTCGTGCCAGC
  • F MiFish-E-F-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC TCGTTG GTAAATCTCGTGCCAGC
  • F MiFish-E-F-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG AGACGT TGGTAAATCTCGTGCCAGC
  • F MiFish-E-F-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA CACAMM GTTGGTAAATCTCGTGCCAGC
  • R MiFish-E-R-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACGAT CATAGT GGGGTATCTAATCCTAGTTTG
  • R MiFish-E-R-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TCATGA TGCATA GTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
  • R MiFish-E-R-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AGTCTC ATGBCA TAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
  • R MiFish-E-R-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CTGACG GCABAS CATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG

 ここでは、A,B,C,Dの4種のプライマーを混合したときに、最初の6塩基がNになるように、各プライマーを設計している。最初の6塩基にはNなどの縮重コードを入れないようにする。これは、縮重コードで発注すると、メーカーによって塩基に大きな偏りがあることがしばしばあり、例えば「N」は実際にはほとんど「T」であることが多いためである。このように4種類のものを混合することで、同じ位置の塩基の比率が均一になる。また、その後ろで長さをばらつかせることで、それ以降の配列における同じ位置の塩基の多様度も向上する。デオキシイノシン「I」は、「C」が最も付きやすく、「A」、「T」、「G」の順に付きにくくなっていく。そこで、とりあえず「G or T = K」とみなして他のプライマーを設計する。

最終更新時間:2018年05月28日 22時03分22秒