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Illumina用インデックス付きプライマー

[系統解析のための色々]

Illumina用インデックス付きプライマー

 Illuminaのシーケンサでマルチプレックスする場合、アダプター付きプライマーでPCRした増幅産物に、アダプターにアニールするインデックス付きプライマーを用いてPCRすることで、さらにインデックスとP5・P7配列を付加する。

P5・P7配列とインデックス配列、プライマー配列

  • F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXTCGTCGGCAGCGTC
  • R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTCTCGTGGGCTCGG

 Xがインデックス配列。R側のインデックス配列を逆相補にした配列がインデックス1、F側のインデックス配列がインデックス2として解読されることに注意すること。

作成例

  • F 01-TACCTTGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTACCTTGATCGTCGGCAGCGTC
  • F 02-AACGTGAA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACGTGAATCGTCGGCAGCGTC
  • F 03-GACGTTCG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGACGTTCGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 04-TCTCTAGG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTCTAGGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 05-TACTGCAA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTACTGCAATCGTCGGCAGCGTC
  • F 06-TTGCAGGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTGCAGGATCGTCGGCAGCGTC
  • F 07-AGCTGGAT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGCTGGATTCGTCGGCAGCGTC
  • F 08-ACCAAGGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACCAAGGATCGTCGGCAGCGTC
  • F 09-TTCCTACC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTCCTACCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 10-ACCTACTT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACCTACTTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 11-TGACCTAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGACCTACTCGTCGGCAGCGTC
  • F 12-GACTGTGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGACTGTGTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 13-ACACCTGG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACCTGGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 14-AGACACGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGACACGTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 15-TGGTACCT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGGTACCTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 16-TTGGACAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTGGACACTCGTCGGCAGCGTC
  • F 17-TCTCCTCA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTCCTCATCGTCGGCAGCGTC
  • F 18-TAGGAAGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGGAAGTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 19-GAGAGCAT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAGAGCATTCGTCGGCAGCGTC
  • F 20-TTGACGTG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTGACGTGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 21-AGATCCTC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGATCCTCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 22-AACAACAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACAACACTCGTCGGCAGCGTC
  • F 23-TCAGATGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCAGATGATCGTCGGCAGCGTC
  • F 24-TACAGTCC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTACAGTCCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 25-ACTGATCT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGATCTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 26-AGTCTCAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGTCTCACTCGTCGGCAGCGTC
  • F 27-GAACCAGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAACCAGTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 28-ACACAACA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACAACATCGTCGGCAGCGTC
  • F 29-ACTCGATC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTCGATCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 30-TGAAGACA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGAAGACATCGTCGGCAGCGTC
  • F 31-ACGAGACG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACGAGACGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 32-TCAAGGAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCAAGGAGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 33-AGCAGAGC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGCAGAGCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 34-TGAGTCAA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGAGTCAATCGTCGGCAGCGTC
  • F 35-AAGCACTA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGCACTATCGTCGGCAGCGTC
  • F 36-AGGATGTC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGATGTCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 37-ATGAGGAA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATGAGGAATCGTCGGCAGCGTC
  • F 38-AGGTGTTG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGTGTTGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 39-GAAGACTT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAAGACTTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 40-TAGTCAAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGTCAACTCGTCGGCAGCGTC
  • F 41-AAGTGAGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGTGAGATCGTCGGCAGCGTC
  • F 42-AACTCTAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACTCTAGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 43-TCCATGCT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCCATGCTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 44-TGACTGTG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGACTGTGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 45-GAAGGAAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAAGGAACTCGTCGGCAGCGTC
  • F 46-TCACACTC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCACACTCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 47-AGAGTTGC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAGTTGCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 48-AGTCCAGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGTCCAGATCGTCGGCAGCGTC
  • F 49-AGACGAAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGACGAAGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 50-TTCGTCGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTCGTCGTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 51-AACACACA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACACACATCGTCGGCAGCGTC
  • F 52-ACATGTCC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACATGTCCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 53-TACTTGTC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTACTTGTCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 54-ACACTGAT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTGATTCGTCGGCAGCGTC
  • F 55-TAGATCCA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCCATCGTCGGCAGCGTC
  • F 56-TGTGCTGG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGTGCTGGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 57-ACAACAAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACAACAACTCGTCGGCAGCGTC
  • F 58-TACCAGAT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTACCAGATTCGTCGGCAGCGTC
  • F 59-AGAACTCT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAACTCTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 60-AAGGTACC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGGTACCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 61-TGCACGAA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGCACGAATCGTCGGCAGCGTC
  • F 62-TCTAGTGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTAGTGTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 63-ACTTCCAA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTTCCAATCGTCGGCAGCGTC
  • F 64-ATCGACCA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCGACCATCGTCGGCAGCGTC
  • F 65-ACGTAGAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACGTAGACTCGTCGGCAGCGTC
  • F 66-TCCTGATG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCCTGATGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 67-AAGAAGCT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGAAGCTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 68-TCATCGTA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCATCGTATCGTCGGCAGCGTC
  • F 69-TCGTTCAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTTCAGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 70-ATCCAGTC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCCAGTCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 71-GAACTCAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAACTCAGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 72-TCCTCTGC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCCTCTGCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 73-AGAGAGTA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAGAGTATCGTCGGCAGCGTC
  • F 74-TCAGCACG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCAGCACGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 75-AACCAAGG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACCAAGGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 76-ATGCATCG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATGCATCGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 77-ACAGACAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACAGACAGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 78-TGTGTACT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGTGTACTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 79-ACGATCGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACGATCGTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 80-ACTACGTT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTACGTTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 81-ACAGGAGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACAGGAGTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 82-GACTAGCA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGACTAGCATCGTCGGCAGCGTC
  • F 83-TACACCTT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTACACCTTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 84-AAGACTGC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGACTGCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 85-ACAAGCTA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACAAGCTATCGTCGGCAGCGTC
  • F 86-ATGGTCTG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATGGTCTGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 87-ATCTCAGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCTCAGTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 88-TTGTGTCA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTGTGTCATCGTCGGCAGCGTC
  • F 89-TCTGAGTG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTGAGTGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 90-TGTACATC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGTACATCTCGTCGGCAGCGTC
  • F 91-TCGACAGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGACAGATCGTCGGCAGCGTC
  • F 92-AACCTCCT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACCTCCTTCGTCGGCAGCGTC
  • F 93-AGCTTCGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGCTTCGATCGTCGGCAGCGTC
  • F 94-AACAGGTG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACAGGTGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 95-AGGACCAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGACCAGTCGTCGGCAGCGTC
  • F 96-GAACATCC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAACATCCTCGTCGGCAGCGTC
  • R 01-TACCTTGA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACCTTGAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 02-AACGTGAA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACGTGAAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 03-GACGTTCG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGACGTTCGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 04-TCTCTAGG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCTAGGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 05-TACTGCAA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACTGCAAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 06-TTGCAGGA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGCAGGAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 07-AGCTGGAT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTGGATGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 08-ACCAAGGA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCAAGGAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 09-TTCCTACC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCCTACCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 10-ACCTACTT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCTACTTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 11-TGACCTAC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACCTACGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 12-GACTGTGT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGACTGTGTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 13-ACACCTGG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACACCTGGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 14-AGACACGT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGACACGTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 15-TGGTACCT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTACCTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 16-TTGGACAC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGGACACGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 17-TCTCCTCA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCCTCAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 18-TAGGAAGT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGGAAGTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 19-GAGAGCAT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAGAGCATGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 20-TTGACGTG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACGTGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 21-AGATCCTC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGATCCTCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 22-AACAACAC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACAACACGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 23-TCAGATGA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAGATGAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 24-TACAGTCC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAGTCCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 25-ACTGATCT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACTGATCTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 26-AGTCTCAC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCTCACGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 27-GAACCAGT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAACCAGTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 28-ACACAACA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACACAACAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 29-ACTCGATC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACTCGATCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 30-TGAAGACA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGAAGACAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 31-ACGAGACG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAGACGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 32-TCAAGGAG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGGAGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 33-AGCAGAGC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCAGAGCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 34-TGAGTCAA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGAGTCAAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 35-AAGCACTA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCACTAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 36-AGGATGTC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGATGTCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 37-ATGAGGAA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGAGGAAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 38-AGGTGTTG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGTGTTGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 39-GAAGACTT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAGACTTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 40-TAGTCAAC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTCAACGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 41-AAGTGAGA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGTGAGAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 42-AACTCTAG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACTCTAGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 43-TCCATGCT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCATGCTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 44-TGACTGTG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACTGTGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 45-GAAGGAAC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAGGAACGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 46-TCACACTC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCACACTCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 47-AGAGTTGC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGAGTTGCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 48-AGTCCAGA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCCAGAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 49-AGACGAAG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGACGAAGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 50-TTCGTCGT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCGTCGTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 51-AACACACA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACACACAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 52-ACATGTCC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATGTCCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 53-TACTTGTC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACTTGTCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 54-ACACTGAT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACACTGATGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 55-TAGATCCA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 56-TGTGCTGG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGCTGGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 57-ACAACAAC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAACAACGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 58-TACCAGAT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACCAGATGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 59-AGAACTCT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGAACTCTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 60-AAGGTACC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGTACCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 61-TGCACGAA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCACGAAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 62-TCTAGTGT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTAGTGTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 63-ACTTCCAA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACTTCCAAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 64-ATCGACCA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCGACCAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 65-ACGTAGAC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGTAGACGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 66-TCCTGATG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTGATGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 67-AAGAAGCT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGAAGCTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 68-TCATCGTA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCATCGTAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 69-TCGTTCAG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGTTCAGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 70-ATCCAGTC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCCAGTCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 71-GAACTCAG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAACTCAGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 72-TCCTCTGC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTGCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 73-AGAGAGTA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGAGAGTAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 74-TCAGCACG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAGCACGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 75-AACCAAGG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCAAGGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 76-ATGCATCG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGCATCGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 77-ACAGACAG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGACAGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 78-TGTGTACT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGTACTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 79-ACGATCGT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGATCGTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 80-ACTACGTT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACTACGTTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 81-ACAGGAGT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGGAGTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 82-GACTAGCA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGACTAGCAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 83-TACACCTT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACACCTTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 84-AAGACTGC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGACTGCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 85-ACAAGCTA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAGCTAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 86-ATGGTCTG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGGTCTGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 87-ATCTCAGT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCTCAGTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 88-TTGTGTCA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGTGTCAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 89-TCTGAGTG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGAGTGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 90-TGTACATC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTACATCGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 91-TCGACAGA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGACAGAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 92-AACCTCCT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCTCCTGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 93-AGCTTCGA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTTCGAGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 94-AACAGGTG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACAGGTGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 95-AGGACCAG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGACCAGGTCTCGTGGGCTCGG
  • R 96-GAACATCC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAACATCCGTCTCGTGGGCTCGG

 FとR各96種のインデックスを示した。最大で9216サンプルをマルチプレックスすることが可能だが、少なくとも半分の組み合わせは未使用とした方がよい。これは、未使用の組み合わせのサンプルが出現することにより、インデックススイッチと呼ばれる現象が起きる確率を推定することができるようにするためである。インデックススイッチなどによるサンプルの取り違えが生じる可能性を極限まで低下させたい場合は、96サンプルまでのマルチプレックスとし、F側インデックスもR側インデックスも1サンプルでしか使用しないようにする。

IDT社発注用エクセルファイル

 IDT社はエクセルファイルを送信することで、プレート形態で納品してもらうことが可能。マルチチャネルピペット使用を前提とするなら、この形態で納品してもらうのがよい。上記フォワード側96本とリバース側96本のセットを発注するには、こちら↓のエクセルファイルを使用可能。

 なお、IDTはプレート納品は24本から発注できるので、それほど大量のサンプルをマルチプレックスしないのであれば、フォワード側24本、リバース側24本で発注すれば節約することもできる。ただし、インデックスの組み合わせの半分は利用しないようにした方が良いので、多めに発注しておくに越したことはない。96サンプルの場合、フォワード側インデックスは8本×2セット( Ν△箸垢)=16本、リバース側インデックスは12本×2セット(A・Bとする)=24本を用意し、8×12レーンの96ウェルに対して、フォワード側.札奪6レーン・▲札奪6レーン、リバース側Aセット4レーン・Bセット4レーンを使用する。すると、インデックスの組み合わせのうち半分は「あり得ない組み合わせ」となる。そのようなサンプルでの配列の出現数を数えることで、インデックススイッチ(index switching, index hopping, tag jump)が起きる確率をランごとに推定することができる。

ライブラリテスト用プライマー

 上記のインデックス付きプライマーで増幅ができていれば、溶液を数千倍に薄めて下記のプライマーでPCRを行い、電気泳動することで、ライブラリ調製がうまく行っているかどうかをテストすることができる。シーケンスしたら全く読めてなかった、ということになると悲惨なので、必ず確認しておくこと。全サンプルでやる必要はなく(初めてならやった方がいいが)、混合後のサンプルで構わない。

  • フォワードプライマー AATGATACGGCGACCACCGA
  • リバースプライマー CAAGCAGAAGACGGCATACGA

 アニーリング温度は60℃、サイクル数は30〜40程度でよい。

最終更新時間:2017年09月28日 10時02分02秒