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{{category 実験プロトコル}}
*シーケンス反応
PCR産物からポリメラーゼ連鎖反応法を利用して蛍光色素を付加した産物を得る。これを電気泳動することで塩基配列決定を行う。ここではABIのBigDye Terminator v3.1キットを使った10ul反応系で説明する。
*PreMixの希釈について
反応に使用するPreMixはバッファが2.5xの濃度で調製されている。これに適当な量の2.5xバッファ(付属の5xバッファを使うか、[[10xシーケンスバッファ]]を作成して使う)を加えることで希釈可能。濃度を1/16まで薄めて10ul反応系にすることで1/32の消費量での反応が可能。濃度1/8PreMixを10ul反応系にして消費量1/16にしてももちろん構わない。
*必要なもの
-適当なチューブ 1本
-600ulチューブ 1本 or 8連チューブ 1/8本 /sample
-Big Dye Terminator v3.1 PreMix (PreMix 0.5ul + 10xシーケンスバッファ 0.875ul + ミリQ 2.625ul) 4ul /sample
-10uM Sequencing Primer 0.32ul /sample
-ミリQ 3.68ul /sample
-鋳型DNA水溶液 2ul (1ng/100bpになるように調整)
-Big Dye Terminator v3.1 PreMix (PreMix 0.5ul + [[10xシーケンスバッファ]] 0.875ul + ミリQ 2.625ul) 4ul /sample
-10uM Sequencing Primer 0.5ul (5pmol) /sample
-ミリQ 3.5ul /sample
-鋳型DNA水溶液 2ul (10ng/100bpになるように調整)
鋳型以外を混合後、粘性が少々高いため分注する際に若干多めに取ってしまいやすいのと、サーマルサイクラーでの反応時の蒸発を考慮して1サンプル当たり0.25ul、8サンプル当たり2ulミリQを多めに加えると、分注で液が不足するのを防ぐことができる。
*手順
+鋳型DNA以外の試薬を適当なチューブで混合
+鋳型DNAをサーマルサイクラーにセットするチューブに入れる
+1で混合した試薬を2に分注する
+サーマルサイクラーにセットして反応
*典型的な反応サイクル
+96℃ 1m
+96℃ 10s
+50℃ 5s
+60℃ 4m 2へ30回
+4℃でhold
600ulチューブの場合は熱伝導に時間がかかるので96℃ 20s、50℃ 15s、60℃ 4.5mにする。
*反応後の精製
以下は10ul反応系の場合である。
+125mM EDTA 1ulと[[3M 酢酸ナトリウム pH5.2]] 1ulを加える
+100% エタノール 25ulを加える
+転倒混和して15分以上室温で放置
+20,000×gで15分以上遠心(低温でブレーキ弱推奨)
+[[プレート遠心機による排液]]
+70% エタノール 50ulでリンス
+20,000×gで5分以上遠心(常温)
+[[プレート遠心機による排液]]
*精製後の処理
+乾燥
+Hi-Diホルムアミド 15ulを加えてサンプルを溶解(この状態で冷蔵なら1週間、冷凍なら1ヶ月まで遮光保存可能)
+サーマルサイクラーなどで95℃ 2m加熱
+氷冷(アルミ製のチューブラックを冷凍しておくとよい)
+サンプルチューブに移して専用のセプタでフタをする
+サンプルトレイにセットしてシーケンス