PCR with Phusionの変更点

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{{category 実験プロトコル}}
*PCR with Phusion
　PhusionでのPCRプロトコル。
*必要なもの
-適当なチューブ 1本
-600ulチューブ 1本 or 8連チューブ 1/8本 /sample
-5x Phusion HF Buffer 4ul /sample
-10mM(2.5mM each) dNTPs Mixture 2ul /sample
-5〜10uM Primer 2ul x2 /sample
-ミリQ 8.8ul /sample
-Phusion 0.2ul /sample
-鋳型DNA水溶液 1ul
*手順
+使用するチューブが入るチューブ立てを冷凍庫に入れておく
+チューブに5x Phusion HF Buffer 4ul、10mM(2.5mM each) dNTPs Mixture 2ul、5〜10uM Primer 2ul x2、ミリQ 8.8ulをサンプル数+2(ネガコン+マージン)だけ入れる
+使用するチューブに鋳型DNA水溶液を1ul(ネガコンではSPW 1ul)入れておく (あらかじめ薄くしておいてピペットで取りやすい量入れてもよい。ただし2でミリQを減らすこと)
+2を氷上に移してPhusion 0.2ulをサンプル数+2倍加える
+3を1のチューブ立てに移して4を19ulずつ加える
+必要ならミネラルオイルを一滴加える
+サーマルサイクラーにセットしてPCR
+アガロースゲル電気泳動でスクリーニング
*典型的な反応サイクル
+98℃ 30s
+98℃ 10s
+48℃ 30s
+72℃ 60s 2へ30回
+72℃ 30s 2へ30回
+72℃ 5m
　HotStart用でも同じ。アニーリング温度はTaqでの場合より+3℃にする。
　HotStart用でも同じ。アニーリング温度は'''Taq'''での場合より+3℃にする。伸長時間は'''Taq'''の半分。