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{{category 系統解析のための色々}}
*Illumina用アダプター付きプライマー
Illuminaのシーケンサでマルチプレックスする場合、アダプター付きプライマーでPCRを行うことで、PCR産物にアダプターを付加する。また、シーケンス時に最初の6塩基の多様性が高くなるように、最初の6塩基がコンセンサスを取ったときにNになるようにする。具体的には、4種類のプライマーを用意し、それぞれにTGCAGT、CATGTC、ACGTAG、GTACCAを付加する。これらを混合すると、最初の6塩基はNとなる。さらに、その後ろにNを0塩基にしたものと2塩基にしたものと4塩基にしたものと6塩基にしたものを混合して使用する。このNも、コンセンサスがNになるように決定する(実際にはNにせず、コンセンサスがNになるようにする)。また、GC含量が半分程度になるように留意する。なお、最初の6塩基がNになることが最重要なので、その後ろの長さに変異を持たせるのが面倒であれば省略してもよい。
Illuminaのシーケンサでは、解読中の塩基が多様なほど解読の質が高まります。これは、カメラで光を検出しているため、同一塩基ばかりのサンプルでは光が飽和して異なる点が区別できなくなってしまう性質があるためです。特に、最初の6塩基で塩基の多様度が低く、異なる点が区別できない場合、ほとんどデータが得られません。そこで、読み始めになるアダプター配列直後に6塩基のNを挿入することで、塩基多様度を最大化します。
アダプター配列直後に6塩基のNを挿入するだけでも通常は問題ありませんが、7塩基目以降も塩基多様度が高いに越したことはありません。そこで、6塩基のNの直後にさらに2塩基・4塩基・6塩基を付加したものと、何も付加しないもの、合計4種類のプライマーを等濃度で等量混合することで、増幅産物の長さに変異を持たせます。
プライマーはIDT社に合成を依頼するようにしましょう。他社では縮重塩基が均等な比率にならず、特定の塩基に偏ってしまいますが、IDT社に依頼したプライマーではほとんど偏りがありません。
*アダプター配列
以下はNexteraで使用されているアダプター配列。
-F TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG''NNNNNN''
-R GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG''NNNNNN''
また、以下のTruSeqで使用されているアダプター配列でも使用可能です。
-F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT''NNNNNN''
-R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT''NNNNNN''
*作成例
-F Euk1391f-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GTACAC ACCGCCCGTC
-F Euk1391f-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC CAGTAC ACACCGCCCGTC
-F Euk1391f-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG AGCAGT ACACACCGCCCGTC
-F Euk1391f-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA TCTGYR GTACACACCGCCCGTC
-R EukBr-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT TGATCC TTCTGCAGGTTCACCTAC
-R EukBr-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC ACTGAT CCTTCTGCAGGTTCACCTAC
-R EukBr-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG GAGCTG ATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC
-R EukBr-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA CTCAGA TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC
-F jgLCO1490-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT TITCIA CIAAYCAYAARGAYATTGG
-F jgLCO1490-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC CMTITC IACIAAYCAYAARGAYATTGG
-F jgLCO1490-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG ARVMTI TCIACIAAYCAYAARGAYATTGG
-F jgLCO1490-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA GYVAMK TITCIACIAAYCAYAARGAYATTGG
-R mlCOIintR-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GGRGGR TASACSGTTCASCCSGTSCC
-R mlCOIintR-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC ATGGRG GRTASACSGTTCASCCSGTSCC
-R mlCOIintR-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG CAYHGG RGGRTASACSGTTCASCCSGTSCC
-R mlCOIintR-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA TCCHYY GGRGGRTASACSGTTCASCCSGTSCC
-F mlCOIintF-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GGWACW GGWTGAACWGTWTAYCCYCC
-F mlCOIintF-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC TAGGWA CWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
-F mlCOIintF-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG CTCTGG WACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
-F mlCOIintF-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA ACACWC GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
-R jgHCO2198-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT TAIACY TCIGGRTGICCRAARAAYCA
-R jgHCO2198-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC AGTAIA CYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
-R jgHCO2198-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG CTCBTA IACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
-R jgHCO2198-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA GCABRG TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
-F MiFish-U-F-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GTCGGT AAAACTCGTGCCAGC
-F MiFish-U-F-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC TAGTCG GTAAAACTCGTGCCAGC
-F MiFish-U-F-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG ACTAGT CGGTAAAACTCGTGCCAGC
-F MiFish-U-F-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA CGACWM GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC
-R MiFish-U-R-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT CATAGT GGGGTATCTAATCCCAGTTTG
-R MiFish-U-R-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC GTCATA GTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
-R MiFish-U-R-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG AGABCA TAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
-R MiFish-U-R-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA TCGBAS CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
-F MiFish-E-F-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GTTGGT AAATCTCGTGCCAGC
-F MiFish-E-F-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC TCGTTG GTAAATCTCGTGCCAGC
-F MiFish-E-F-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG AGACGT TGGTAAATCTCGTGCCAGC
-F MiFish-E-F-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA CACAMM GTTGGTAAATCTCGTGCCAGC
-R MiFish-E-R-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT CATAGT GGGGTATCTAATCCTAGTTTG
-R MiFish-E-R-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC TGCATA GTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
-R MiFish-E-R-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG ATGBCA TAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
-R MiFish-E-R-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA GCABAS CATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
ここでは、A,B,C,Dの4種のプライマーを混合したときに、最初の6塩基がNになるように、各プライマーを設計している。最初の6塩基にはNなどの縮重コードを入れないようにする。これは、縮重コードで発注すると、メーカーによって塩基に大きな偏りがあることがしばしばあり、例えば「N」は実際にはほとんど「T」であることが多いためである。このように4種類のものを混合することで、同じ位置の塩基の比率が均一になる。また、その後ろで長さをばらつかせることで、それ以降の配列における同じ位置の塩基の多様度も向上する。デオキシイノシン「I」は、「C」が最も付きやすく、「A」、「T」、「G」の順に付きにくくなっていく。そこで、とりあえず「G or T = K」とみなして他のプライマーを設計する。
-F Euk1391f-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN GTACAC ACCGCCCGTC
-F Euk1391f-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HVGTAC ACACCGCCCGTC
-F Euk1391f-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HVYRGT ACACACCGCCCGTC
-F Euk1391f-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HVYRYR GTACACACCGCCCGTC
-R EukBr-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN TGATCC TTCTGCAGGTTCACCTAC
-R EukBr-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN VHTGAT CCTTCTGCAGGTTCACCTAC
-R EukBr-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN VHSMTG ATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC
-R EukBr-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN VHSMGA TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC
-F jgLCO1490-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN TITCIA CIAAYCAYAARGAYATTGG
-F jgLCO1490-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN VNTITC IACIAAYCAYAARGAYATTGG
-F jgLCO1490-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN VNVDTI TCIACIAAYCAYAARGAYATTGG
-F jgLCO1490-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN VNVNVK TITCIACIAAYCAYAARGAYATTGG
-R mlCOIintR-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN GGRGGR TASACSGTTCASCCSGTSCC
-R mlCOIintR-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HHGGRG GRTASACSGTTCASCCSGTSCC
-R mlCOIintR-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HHYHGG RGGRTASACSGTTCASCCSGTSCC
-R mlCOIintR-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HHHHYY GGRGGRTASACSGTTCASCCSGTSCC
-F mlCOIintF-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN GGWACW GGWTGAACWGTWTAYCCYCC
-F mlCOIintF-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HHGGWA CWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
-F mlCOIintF-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HHSYGG WACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
-F mlCOIintF-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HHHYWC GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
-R jgHCO2198-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN TAIACY TCIGGRTGICCRAARAAYCA
-R jgHCO2198-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN VBTAIA CYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
-R jgHCO2198-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN VBNBTA IACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
-R jgHCO2198-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN VBVBRG TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
-F MiFish-U-F-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN GTCGGT AAAACTCGTGCCAGC
-F MiFish-U-F-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HVGTCG GTAAAACTCGTGCCAGC
-F MiFish-U-F-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HVWMGT CGGTAAAACTCGTGCCAGC
-F MiFish-U-F-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HVWMWM GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC
-R MiFish-U-R-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN CATAGT GGGGTATCTAATCCCAGTTTG
-R MiFish-U-R-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN DBCATA GTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
-R MiFish-U-R-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN DBRBCA TAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
-R MiFish-U-R-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN DBRBAS CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
-F MiFish-E-F-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN GTTGGT AAATCTCGTGCCAGC
-F MiFish-E-F-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HVGTTG GTAAATCTCGTGCCAGC
-F MiFish-E-F-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HVMMGT TGGTAAATCTCGTGCCAGC
-F MiFish-E-F-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN HVMMMM GTTGGTAAATCTCGTGCCAGC
-R MiFish-E-R-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN CATAGT GGGGTATCTAATCCTAGTTTG
-R MiFish-E-R-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN DBCATA GTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
-R MiFish-E-R-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN DBRBCA TAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
-R MiFish-E-R-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN DBRBAS CATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
ここでは、A,B,C,Dの4種のプライマーを混合したときに、読み始めの6塩基がNになるように、各プライマーを設計している。また、その後ろで長さをばらつかせることで、それ以降の配列における同じ位置の塩基の多様度も向上する。