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{{category 系統解析のための色々}}
*Illumina用インデックス付きプライマー
Illuminaのシーケンサでマルチプレックスする場合、アダプター付きプライマーでPCRした増幅産物に、アダプターにアニールするインデックス付きプライマーを用いてPCRすることで、さらにインデックスとP5・P7配列を付加する。
*P5・P7配列とインデックス配列、プライマー配列
-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXTCGTCGGCAGCGTC
-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTCTCGTGGGCTCGG
Xがインデックス配列。R側のインデックス配列を逆相補にした配列がインデックス1、F側のインデックス配列がインデックス2として解読されることに注意すること。
*作成例
-F 01-TACCTTGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTACCTTGATCGTCGGCAGCGTC
-F 02-AACGTGAA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACGTGAATCGTCGGCAGCGTC
-F 03-GACGTTCG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGACGTTCGTCGTCGGCAGCGTC
-F 04-TCTCTAGG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTCTAGGTCGTCGGCAGCGTC
-F 05-TACTGCAA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTACTGCAATCGTCGGCAGCGTC
-F 06-TTGCAGGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTGCAGGATCGTCGGCAGCGTC
-F 07-AGCTGGAT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGCTGGATTCGTCGGCAGCGTC
-F 08-ACCAAGGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACCAAGGATCGTCGGCAGCGTC
-F 09-TTCCTACC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTCCTACCTCGTCGGCAGCGTC
-F 10-ACCTACTT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACCTACTTTCGTCGGCAGCGTC
-F 11-TGACCTAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGACCTACTCGTCGGCAGCGTC
-F 12-GACTGTGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGACTGTGTTCGTCGGCAGCGTC
-F 13-ACACCTGG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACCTGGTCGTCGGCAGCGTC
-F 14-AGACACGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGACACGTTCGTCGGCAGCGTC
-F 15-TGGTACCT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGGTACCTTCGTCGGCAGCGTC
-F 16-TTGGACAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTGGACACTCGTCGGCAGCGTC
-F 17-TCTCCTCA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTCCTCATCGTCGGCAGCGTC
-F 18-TAGGAAGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGGAAGTTCGTCGGCAGCGTC
-F 19-GAGAGCAT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAGAGCATTCGTCGGCAGCGTC
-F 20-TTGACGTG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTGACGTGTCGTCGGCAGCGTC
-F 21-AGATCCTC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGATCCTCTCGTCGGCAGCGTC
-F 22-AACAACAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACAACACTCGTCGGCAGCGTC
-F 23-TCAGATGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCAGATGATCGTCGGCAGCGTC
-F 24-TACAGTCC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTACAGTCCTCGTCGGCAGCGTC
-F 25-ACTGATCT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGATCTTCGTCGGCAGCGTC
-F 26-AGTCTCAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGTCTCACTCGTCGGCAGCGTC
-F 27-GAACCAGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAACCAGTTCGTCGGCAGCGTC
-F 28-ACACAACA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACAACATCGTCGGCAGCGTC
-F 29-ACTCGATC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTCGATCTCGTCGGCAGCGTC
-F 30-TGAAGACA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGAAGACATCGTCGGCAGCGTC
-F 31-ACGAGACG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACGAGACGTCGTCGGCAGCGTC
-F 32-TCAAGGAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCAAGGAGTCGTCGGCAGCGTC
-F 33-AGCAGAGC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGCAGAGCTCGTCGGCAGCGTC
-F 34-TGAGTCAA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGAGTCAATCGTCGGCAGCGTC
-F 35-AAGCACTA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGCACTATCGTCGGCAGCGTC
-F 36-AGGATGTC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGATGTCTCGTCGGCAGCGTC
-F 37-ATGAGGAA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATGAGGAATCGTCGGCAGCGTC
-F 38-AGGTGTTG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGTGTTGTCGTCGGCAGCGTC
-F 39-GAAGACTT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAAGACTTTCGTCGGCAGCGTC
-F 40-TAGTCAAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGTCAACTCGTCGGCAGCGTC
-F 41-AAGTGAGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGTGAGATCGTCGGCAGCGTC
-F 42-AACTCTAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACTCTAGTCGTCGGCAGCGTC
-F 43-TCCATGCT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCCATGCTTCGTCGGCAGCGTC
-F 44-TGACTGTG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGACTGTGTCGTCGGCAGCGTC
-F 45-GAAGGAAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAAGGAACTCGTCGGCAGCGTC
-F 46-TCACACTC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCACACTCTCGTCGGCAGCGTC
-F 47-AGAGTTGC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAGTTGCTCGTCGGCAGCGTC
-F 48-AGTCCAGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGTCCAGATCGTCGGCAGCGTC
-F 49-AGACGAAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGACGAAGTCGTCGGCAGCGTC
-F 50-TTCGTCGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTCGTCGTTCGTCGGCAGCGTC
-F 51-AACACACA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACACACATCGTCGGCAGCGTC
-F 52-ACATGTCC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACATGTCCTCGTCGGCAGCGTC
-F 53-TACTTGTC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTACTTGTCTCGTCGGCAGCGTC
-F 54-ACACTGAT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTGATTCGTCGGCAGCGTC
-F 55-TAGATCCA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCCATCGTCGGCAGCGTC
-F 56-TGTGCTGG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGTGCTGGTCGTCGGCAGCGTC
-F 57-ACAACAAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACAACAACTCGTCGGCAGCGTC
-F 58-TACCAGAT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTACCAGATTCGTCGGCAGCGTC
-F 59-AGAACTCT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAACTCTTCGTCGGCAGCGTC
-F 60-AAGGTACC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGGTACCTCGTCGGCAGCGTC
-F 61-TGCACGAA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGCACGAATCGTCGGCAGCGTC
-F 62-TCTAGTGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTAGTGTTCGTCGGCAGCGTC
-F 63-ACTTCCAA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTTCCAATCGTCGGCAGCGTC
-F 64-ATCGACCA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCGACCATCGTCGGCAGCGTC
-F 65-ACGTAGAC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACGTAGACTCGTCGGCAGCGTC
-F 66-TCCTGATG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCCTGATGTCGTCGGCAGCGTC
-F 67-AAGAAGCT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGAAGCTTCGTCGGCAGCGTC
-F 68-TCATCGTA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCATCGTATCGTCGGCAGCGTC
-F 69-TCGTTCAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTTCAGTCGTCGGCAGCGTC
-F 70-ATCCAGTC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCCAGTCTCGTCGGCAGCGTC
-F 71-GAACTCAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAACTCAGTCGTCGGCAGCGTC
-F 72-TCCTCTGC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCCTCTGCTCGTCGGCAGCGTC
-F 73-AGAGAGTA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAGAGTATCGTCGGCAGCGTC
-F 74-TCAGCACG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCAGCACGTCGTCGGCAGCGTC
-F 75-AACCAAGG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACCAAGGTCGTCGGCAGCGTC
-F 76-ATGCATCG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATGCATCGTCGTCGGCAGCGTC
-F 77-ACAGACAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACAGACAGTCGTCGGCAGCGTC
-F 78-TGTGTACT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGTGTACTTCGTCGGCAGCGTC
-F 79-ACGATCGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACGATCGTTCGTCGGCAGCGTC
-F 80-ACTACGTT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTACGTTTCGTCGGCAGCGTC
-F 81-ACAGGAGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACAGGAGTTCGTCGGCAGCGTC
-F 82-GACTAGCA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGACTAGCATCGTCGGCAGCGTC
-F 83-TACACCTT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTACACCTTTCGTCGGCAGCGTC
-F 84-AAGACTGC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGACTGCTCGTCGGCAGCGTC
-F 85-ACAAGCTA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACAAGCTATCGTCGGCAGCGTC
-F 86-ATGGTCTG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATGGTCTGTCGTCGGCAGCGTC
-F 87-ATCTCAGT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCTCAGTTCGTCGGCAGCGTC
-F 88-TTGTGTCA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTGTGTCATCGTCGGCAGCGTC
-F 89-TCTGAGTG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTGAGTGTCGTCGGCAGCGTC
-F 90-TGTACATC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGTACATCTCGTCGGCAGCGTC
-F 91-TCGACAGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGACAGATCGTCGGCAGCGTC
-F 92-AACCTCCT-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACCTCCTTCGTCGGCAGCGTC
-F 93-AGCTTCGA-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGCTTCGATCGTCGGCAGCGTC
-F 94-AACAGGTG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACAGGTGTCGTCGGCAGCGTC
-F 95-AGGACCAG-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGACCAGTCGTCGGCAGCGTC
-F 96-GAACATCC-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAACATCCTCGTCGGCAGCGTC
-R 01-TACCTTGA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACCTTGAGTCTCGTGGGCTCGG
-R 02-AACGTGAA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACGTGAAGTCTCGTGGGCTCGG
-R 03-GACGTTCG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGACGTTCGGTCTCGTGGGCTCGG
-R 04-TCTCTAGG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCTAGGGTCTCGTGGGCTCGG
-R 05-TACTGCAA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACTGCAAGTCTCGTGGGCTCGG
-R 06-TTGCAGGA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGCAGGAGTCTCGTGGGCTCGG
-R 07-AGCTGGAT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTGGATGTCTCGTGGGCTCGG
-R 08-ACCAAGGA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCAAGGAGTCTCGTGGGCTCGG
-R 09-TTCCTACC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCCTACCGTCTCGTGGGCTCGG
-R 10-ACCTACTT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCTACTTGTCTCGTGGGCTCGG
-R 11-TGACCTAC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACCTACGTCTCGTGGGCTCGG
-R 12-GACTGTGT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGACTGTGTGTCTCGTGGGCTCGG
-R 13-ACACCTGG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACACCTGGGTCTCGTGGGCTCGG
-R 14-AGACACGT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGACACGTGTCTCGTGGGCTCGG
-R 15-TGGTACCT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTACCTGTCTCGTGGGCTCGG
-R 16-TTGGACAC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGGACACGTCTCGTGGGCTCGG
-R 17-TCTCCTCA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCCTCAGTCTCGTGGGCTCGG
-R 18-TAGGAAGT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGGAAGTGTCTCGTGGGCTCGG
-R 19-GAGAGCAT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAGAGCATGTCTCGTGGGCTCGG
-R 20-TTGACGTG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACGTGGTCTCGTGGGCTCGG
-R 21-AGATCCTC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGATCCTCGTCTCGTGGGCTCGG
-R 22-AACAACAC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACAACACGTCTCGTGGGCTCGG
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-R 55-TAGATCCA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGG
-R 56-TGTGCTGG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGCTGGGTCTCGTGGGCTCGG
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-R 59-AGAACTCT-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGAACTCTGTCTCGTGGGCTCGG
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-R 64-ATCGACCA-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCGACCAGTCTCGTGGGCTCGG
-R 65-ACGTAGAC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGTAGACGTCTCGTGGGCTCGG
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-R 94-AACAGGTG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACAGGTGGTCTCGTGGGCTCGG
-R 95-AGGACCAG-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGACCAGGTCTCGTGGGCTCGG
-R 96-GAACATCC-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAACATCCGTCTCGTGGGCTCGG
FとR各96種のインデックスを示した。最大で9216サンプルをマルチプレックスすることが可能だが、少なくとも半分の組み合わせは未使用とした方がよい。これは、未使用の組み合わせのサンプルが出現することにより、インデックススイッチと呼ばれる現象が起きる確率を推定することができるようにするためである。インデックススイッチなどによるサンプルの取り違えが生じる可能性を極限まで低下させたい場合は、96サンプルまでのマルチプレックスとし、F側インデックスもR側インデックスも1サンプルでしか使用しないようにする。
*IDT社発注用エクセルファイル
IDT社はエクセルファイルを送信することで、プレート形態で納品してもらうことが可能。マルチチャネルピペット使用を前提とするなら、この形態で納品してもらうのがよい。上記フォワード側96本とリバース側96本のセットを発注するには、こちら↓のエクセルファイルを使用可能。
-フォワードプライマー96本用 {{ref forwardprimer.xls}}
-リバースプライマー96本用 {{ref reverseprimer.xls}}
なお、IDTはプレート納品は24本から発注できるので、それほど大量のサンプルをマルチプレックスしないのであれば、フォワード側24本、リバース側24本で発注すれば節約することもできる。ただし、インデックスの組み合わせの半分は利用しないようにした方が良いので、多めに発注しておくに越したことはない。96サンプルの場合、フォワード側インデックスは8本×2セット(� Ν△箸垢�)=16本、リバース側インデックスは12本×2セット(A・Bとする)=24本を用意し、8×12レーンの96ウェルに対して、フォワード側�．札奪�6レーン・�▲札奪�6レーン、リバース側Aセット4レーン・Bセット4レーンを使用する。すると、インデックスの組み合わせのうち半分は「あり得ない組み合わせ」となる。そのようなサンプルでの配列の出現数を数えることで、インデックススイッチ(index switching, index hopping, tag jump)が起きる確率をランごとに推定することができる。
IDT社はエクセルファイルを送信することでプレート形態で納品してもらうことが可能。マルチチャネルピペット使用を前提とするなら、この形態で納品してもらうのがよい。ただし、プライマーのコンタミを避けるには、全プライマーを独立したチューブで発注し、マルチチャネルピペットは使わずにシングル電動ピペットでの連続分注を行う方がよい。なお、プライマー発注時の濃度は50μMが望ましい。分注する際には5μMにするため(10μMだと1ウェルに入れる液量が1μLを下回るので容量が不正確になりやすい)。フォワード側24本8セット(合計192本)とリバース側36本8セット(合計288本)を発注するには、こちら↓のエクセルファイルを使用可能。1塩基13円であれば、全て注文すると303,264円となる。
-フォワードプライマー24本ABC {{ref forwardprimer-v2_ABC.xls}}
-フォワードプライマー24本DEF {{ref forwardprimer-v2_DEF.xls}}
-フォワードプライマー24本GHI {{ref forwardprimer-v2_GHI.xls}}
-フォワードプライマー24本JKL {{ref forwardprimer-v2_JKL.xls}}
-フォワードプライマー24本MNO {{ref forwardprimer-v2_MNO.xls}}
-フォワードプライマー24本PQR {{ref forwardprimer-v2_PQR.xls}}
-フォワードプライマー24本STU {{ref forwardprimer-v2_STU.xls}}
-フォワードプライマー24本VWX {{ref forwardprimer-v2_VWX.xls}}
-リバースプライマー36本ABC {{ref reverseprimer-v2_ABC.xls}}
-リバースプライマー36本DEF {{ref reverseprimer-v2_DEF.xls}}
-リバースプライマー36本GHI {{ref reverseprimer-v2_GHI.xls}}
-リバースプライマー36本JKL {{ref reverseprimer-v2_JKL.xls}}
-リバースプライマー36本MNO {{ref reverseprimer-v2_MNO.xls}}
-リバースプライマー36本PQR {{ref reverseprimer-v2_PQR.xls}}
-リバースプライマー36本STU {{ref reverseprimer-v2_STU.xls}}
-リバースプライマー36本VWX {{ref reverseprimer-v2_VWX.xls}}
フォワードのAに対してはリバースのAを組み合わせる。他の組み合わせも使用しても構わないが、上記インデックスではA-A、B-B・・・X-Xの組み合わせだけでも2304サンプルはマルチプレックス可能。使用しない組み合わせを大量に用意することで、index switching (tag jumpingあるいはindex hoppingとも呼ばれる)の起きる確率をランごとに推定可能になる。最低でも半分は使用しない組み合わせにすること。ダメな組み合わせ例は、384サンプルに対してA-A, A-B, B-A, B-B (全組み合わせを使用してしまっている)。良い組み合わせ例は、A-A, B-B, C-C, D-D (A-Bなどの組み合わせが未使用)や、A-A, A-B, B-C, B-D (A-C, A-D, B-A, B-Bが未使用)。
*ライブラリテスト用プライマー
上記のインデックス付きプライマーで増幅ができていれば、溶液を数千倍に薄めて下記のプライマーでPCRを行い、電気泳動することで、ライブラリ調製がうまく行っているかどうかをテストすることができる。シーケンスしたら全く読めてなかった、ということになると悲惨なので、必ず確認しておくこと。全サンプルでやる必要はなく(初めてならやった方がいいが)、混合後のサンプルで構わない。
-フォワードプライマー AATGATACGGCGACCACCGA
-リバースプライマー CAAGCAGAAGACGGCATACGA
アニーリング温度は60℃、サイクル数は30〜40程度でよい。