{{category 系統解析のための色々}}

*Illumina用アダプター付きプライマー
　Illuminaのシーケンサでは、解読中の塩基が多様なほど解読の質が高まります。これは、カメラで光を検出しているため、同一塩基ばかりのサンプルでは光が飽和して異なる点が区別できなくなってしまう性質があるためです。特に、最初の6塩基で塩基の多様度が低く、異なる点が区別できない場合、ほとんどデータが得られません。そこで、読み始めになるアダプター配列直後に6塩基のNを挿入することで、塩基多様度を最大化します。

　アダプター配列直後に6塩基のNを挿入するだけでも通常は問題ありませんが、7塩基目以降も塩基多様度が高いに越したことはありません。そこで、6塩基のNの直後にさらに2塩基・4塩基・6塩基を付加したものと、何も付加しないもの、合計4種類のプライマーを等濃度で等量混合することで、増幅産物の長さに変異を持たせます。
*アダプター配列
以下はNexteraで使用されているアダプター配列。
-F TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG''NNNNNN''
-R GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG''NNNNNN''
また、以下のTruSeqで使用されているアダプター配列でも使用可能です。
-F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT''NNNNNN''
-R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT''NNNNNN''
*作成例
-F Euk1391f-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GTACAC ACCGCCCGTC
-F Euk1391f-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC CAGTAC ACACCGCCCGTC
-F Euk1391f-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG AGCAGT ACACACCGCCCGTC
-F Euk1391f-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA TCTGYR GTACACACCGCCCGTC
-R EukBr-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACGAT TGATCC TTCTGCAGGTTCACCTAC
-R EukBr-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TCATGA ACTGAT CCTTCTGCAGGTTCACCTAC
-R EukBr-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AGTCTC GAGCTG ATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC
-R EukBr-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CTGACG CTCAGA TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC
-F jgLCO1490-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT TITCIA CIAAYCAYAARGAYATTGG
-F jgLCO1490-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC CMTITC IACIAAYCAYAARGAYATTGG
-F jgLCO1490-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG ARVMTI TCIACIAAYCAYAARGAYATTGG
-F jgLCO1490-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA GYVAMK TITCIACIAAYCAYAARGAYATTGG
-R mlCOIintR-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACGAT GGRGGR TASACSGTTCASCCSGTSCC
-R mlCOIintR-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TCATGA ATGGRG GRTASACSGTTCASCCSGTSCC
-R mlCOIintR-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AGTCTC CAYHGG RGGRTASACSGTTCASCCSGTSCC
-R mlCOIintR-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CTGACG TCCHYY GGRGGRTASACSGTTCASCCSGTSCC
-F mlCOIintF-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GGWACW GGWTGAACWGTWTAYCCYCC
-F mlCOIintF-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC TAGGWA CWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
-F mlCOIintF-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG CTCTGG WACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
-F mlCOIintF-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA ACACWC GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
-R jgHCO2198-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACGAT TAIACY TCIGGRTGICCRAARAAYCA
-R jgHCO2198-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TCATGA AGTAIA CYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
-R jgHCO2198-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AGTCTC CTCBTA IACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
-R jgHCO2198-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CTGACG GCABRG TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
-F MiFish-U-F-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GTCGGT AAAACTCGTGCCAGC
-F MiFish-U-F-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC TAGTCG GTAAAACTCGTGCCAGC
-F MiFish-U-F-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG ACTAGT CGGTAAAACTCGTGCCAGC
-F MiFish-U-F-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA CGACWM GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC
-R MiFish-U-R-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACGAT CATAGT GGGGTATCTAATCCCAGTTTG
-R MiFish-U-R-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TCATGA GTCATA GTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
-R MiFish-U-R-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AGTCTC AGABCA TAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
-R MiFish-U-R-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CTGACG TCGBAS CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
-F MiFish-E-F-A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG TGCAGT GTTGGT AAATCTCGTGCCAGC
-F MiFish-E-F-B TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CATGTC TCGTTG GTAAATCTCGTGCCAGC
-F MiFish-E-F-C TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG ACGTAG AGACGT TGGTAAATCTCGTGCCAGC
-F MiFish-E-F-D TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GTACCA CACAMM GTTGGTAAATCTCGTGCCAGC
-R MiFish-E-R-A GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACGAT CATAGT GGGGTATCTAATCCTAGTTTG
-R MiFish-E-R-B GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG TCATGA TGCATA GTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
-R MiFish-E-R-C GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AGTCTC ATGBCA TAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
-R MiFish-E-R-D GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CTGACG GCABAS CATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
　ここでは、A,B,C,Dの4種のプライマーを混合したときに、最初の6塩基がNになるように、各プライマーを設計している。最初の6塩基にはNなどの縮重コードを入れないようにする。これは、縮重コードで発注すると、メーカーによって塩基に大きな偏りがあることがしばしばあり、例えば「N」は実際にはほとんど「T」であることが多いためである。このように4種類のものを混合することで、同じ位置の塩基の比率が均一になる。また、その後ろで長さをばらつかせることで、それ以降の配列における同じ位置の塩基の多様度も向上する。デオキシイノシン「I」は、「C」が最も付きやすく、「A」、「T」、「G」の順に付きにくくなっていく。そこで、とりあえず「G or T = K」とみなして他のプライマーを設計する。