{{category 系統解析のための色々}}

*Illumina用インデックス付きプライマー
　Illuminaのシーケンサでマルチプレックスする場合、アダプター付きプライマーでPCRした増幅産物に、アダプターにアニールするインデックス付きプライマーを用いてPCRすることで、さらにインデックスとP5・P7配列を付加する。

*P5・P7配列とインデックス配列、プライマー配列
-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXTCGTCGGCAGCGTC
-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTCTCGTGGGCTCGG
　Xがインデックス配列。R側のインデックス配列を逆相補にした配列がインデックス1、F側のインデックス配列がインデックス2として解読されることに注意すること。

*IDT社発注用エクセルファイル
　IDT社はエクセルファイルを送信することで、プレート形態で納品してもらうことが可能。マルチチャネルピペット使用を前提とするなら、この形態で納品してもらうのがよい。フォワード側96本2種類とリバース側96本2種類のセットを発注するには、こちら↓のエクセルファイルを使用可能。
-フォワードプライマー96本用その1 {{ref forwardprimers96-v2A.xls}}
-フォワードプライマー96本用その2 {{ref forwardprimers96-v2B.xls}}
-リバースプライマー96本用その1 {{ref reverseprimers96-v2A.xls}}
-リバースプライマー96本用その2 {{ref reverseprimers96-v2B.xls}}
　なお、IDTはプレート納品は24本から発注できるので、それほど大量のサンプルをマルチプレックスしないのであれば、フォワード側24本、リバース側24本で発注すれば節約することもできる。ただし、インデックスの組み合わせの半分は利用しないようにした方が良いので、多めに発注しておくに越したことはない。96サンプルの場合、フォワード側インデックスは8本×2セット(①・②とする)=16本、リバース側インデックスは12本×2セット(A・Bとする)=24本を用意し、8×12レーンの96ウェルに対して、フォワード側①セット6レーン・②セット6レーン、リバース側Aセット4レーン・Bセット4レーンを使用する。すると、インデックスの組み合わせのうち半分は「あり得ない組み合わせ」となる。そのようなサンプルでの配列の出現数を数えることで、インデックススイッチ(index switching, index hopping, tag jump)が起きる確率をランごとに推定することができる。
*ライブラリテスト用プライマー
　上記のインデックス付きプライマーで増幅ができていれば、溶液を数千倍に薄めて下記のプライマーでPCRを行い、電気泳動することで、ライブラリ調製がうまく行っているかどうかをテストすることができる。シーケンスしたら全く読めてなかった、ということになると悲惨なので、必ず確認しておくこと。全サンプルでやる必要はなく(初めてならやった方がいいが)、混合後のサンプルで構わない。
-フォワードプライマー AATGATACGGCGACCACCGA
-リバースプライマー CAAGCAGAAGACGGCATACGA
　アニーリング温度は60℃、サイクル数は30～40程度でよい。