{{category 系統解析のための色々}}

*PCRプライマーの設計
　GeneFisherとGeneWalkerのサイトを利用したPCR用ユニバーサルプライマーの設計方法の概説。
*コンセンサス配列を用意する
　GeneFisherサイトでもアライメントとコンセンサス配列生成はできるが、データが大きい場合はサーバに負担をかけてしまうので好ましくない。そこで、自前で予めコンセンサス配列を用意してGeneFisherに送ることにする。

　まず、対象となる複数の塩基配列をアライメントする。ClustalWなりMAFFTなり好きなものを使えばよい。アライメントが終わったらコンセンサス配列を得る。BioEditなら「Alignment→Create Consensus Sequence」で一発。
*GeneFisherによるユニバーサルプライマー設計
　コンセンサス配列ができたら、GeneFisherのサイトに送る。FASTA形式でフォームに貼り付けるか配列ファイルを指定する。BioEditなら配列を選択して「Edit→Copy sequences to clipboard (Fasta Format)」。

　プライマーデザインパラメータとしては、プライマーの長さ・GC含量・Tm値・PCRプロダクトの長さを指定する。また、3'末端の指定塩基数分のGC含量と末端の塩基も指定できる。以下に推奨設定を記す。

,パラメータ,値
,Length,18-25bp
,GC content,30-60%
,Tm,45-60℃
,Product Size,500-1500bp
,3' length,2bp
,3' GC content,50%
,End primer with,ACGT

　これでいくつかのプライマーセットができあがる。
*GeneWalkerによるPCR増幅シミュレーションチェック
　コンセンサス配列の生成に用いた配列のどれかの、プライマーで増幅する範囲をTarget sequenceに貼り付けてFormat。Primer 1と2にはforward側とreverse側のプライマーを貼り付ける。「Primer dimers」「2:ary struct」「Anneal」でそれぞれできそうなプライマーダイマー・二次構造・アニールする箇所の確認ができる。